ChemBioChem多酶级联催化介导的

在制药工业中，手性纯氨基酸发挥着重要的作用。其中，L-苯甘氨酸可用于合成β-内酰胺类抗生素，如青霉素。此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点。目前已有许多化学合成路线开发用于生产对映体纯氨基酸。例如，Strecker反应是工业化生产α-氨基酸的常用方法。然而，化学方法通常使用对环境有害的有毒试剂和有机溶剂，并且产品的对映选择性相对较低，这对于可持续生产对映体纯氨基酸并不有利。与化学方法相比，生物催化方法通常在温和反应条件下进行，且因其优良的对映选择性被认为是手性化合物生产的有效途径。

为了实现从L-苯丙氨酸绿色可持续生产高价值手性氨基酸L-苯甘氨酸，本文作者首先设计了以大肠杆菌内源转氨酶（AT）依赖的多酶级联路径（图1）进行生产。

图1.从L-苯丙氨酸合成L-苯甘氨酸的多酶级联示意图

如图2a所示，多酶级联被重新构建为三个模块，对含有三种质粒的重组大肠杆菌菌株Ec-Phg1.0进行SDS-PAGE分析（图2b），对实验pH条件进行探索发现L-苯甘氨酸合成的理想pH值约为8.0（图2c）。如图2d所示，将10mML-苯丙氨酸投喂表达五种酶的重组大肠杆菌Ec-Phg1.0，48小时后获得7.21±0.15mML-苯甘氨酸，相当于约72.1%的转化率。根据HPLC结果，作者发现生物催化过程中积累了大量苯甲酰甲酸（BFA）（图2e）。对BFA积累的原因进行探索，最终作者推测LAAD对胺供体L-谷氨酸的消耗是导致BFA积累的重要原因。

图2.氨基转移酶（AT）依赖途径生物催化合成L-苯甘氨酸

接下来，作者重新设计构建蜡样芽胞杆菌亮氨酸脱氢酶（LeuDH）依赖的多酶级联途径用于L-苯甘氨酸的生产（图1）。如图3a所示，作者进一步构建了重组大肠杆菌菌株Ec-Phg2.0，并进行SDS-PAGE分析（图3b）。从图3c和3d中可以看出，当分别使用10mM和40mML-苯丙氨酸作为底物时，12小时后分别产生9.92±0.39mM和39.97±3.84mML-苯甘氨酸，转化率均＞99%，从液相结果可看出中间产物BFA的积累问题得到了解决（图3e）。

图3.亮氨酸脱氢酶（LeuDH）依赖途径生物催化合成L-苯甘氨酸

作者开发了两条人工酶级联路径，从L-苯丙氨酸合成对映体纯氨基酸L-苯甘氨酸。然而，第一条酶级联路径存在中间产物BFA的累积现象，导致目标L-苯甘氨酸的产量偏低。接下来，作者设计了第二条酶级联路径，使用蜡样芽胞杆菌的LeuDH替代AT/GluDH，成功解决了中间产物积累的问题，通过简洁的四步酶级联反应可以有效地将40mML-苯丙氨酸转化为39.97±3.84mM（6.04±0.58g/L）的L-苯甘氨酸，12h转化率99.9%。成功实现从天然可再生底物L-苯丙氨酸生物催化合成L-苯甘氨酸的最高产量。且催化过程中没有明显的中间产物积累，本文的生物催化方法将大大简化产品分离过程，在未来的工业应用中具有巨大的潜力。

论文信息

AFour-StepEnzymaticCascadeforEfficientProductionofL-PhenylglycinefromBiobasedL-Phenylalanine

YulingZhu,Dr.JifengYuan

ChemBioChem

DOI:10./cbic.

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