撮要
宗旨:建设反相高效液相色谱法测定苯丙氨酯及其片剂的相关物资和含量。办法:采取PhenomenexLunaC18色谱柱(4.6mm×mm,5μm),以甲醇-水(60∶40)为崎岖相,流速为1.0mL·min-1,探测波长为nm,柱温为40℃,进样量为20μL。后果:相关物资线性规模为0.51~30.24μg·mL-1,r=0.,检出限为4ng,周详度、褂讪性、反复性实验的RSD≤0.8%;含量测定线性规模为12.60~.82μg·mL-1,r=0.;苯丙氨酯片的均匀回收率为99.7%,RSD=0.6%(n=9);材料含量测定后果为99.3%~99.8%;片剂含量测定后果为99.0%~.6%。论断:本法简洁、确切、专属性好、麻利度高,可用于苯丙氨酯及其片剂的原料遏制。
关键词:苯丙氨酯;高效液相色谱法;相关物资;含量测定;原料遏制
苯丙氨酯是一种具备沉着影响的中心性骨骼肌松驰剂,临床上重要用于腰背、手脚肌腱炎、韧带损伤、肌肉紧急痛、神经痛及风湿性关节炎的诊疗[1]。本品诊疗功效显著,且不过甾体类抗炎药的严峻不良反响,暂时国内有多家企业临盆,个中材料临盆厂家有3家,片剂临盆厂家有38家。苯丙氨酯现行准则含量测定办法为氮测定法[2],片剂含量测定办法为紫外分光光度法[2]和氮测定法[3]。采取氮测定法,实验环节较为噜苏;采取紫外分光光度法,由于采取乙醇为配制溶剂,其蒸发性较大,测定后果受实行室温湿度等实验处境的影响较大,易形成测定后果的禁止确性。鉴于本品现行准则为《中华国民共和国药典》年版,测定办法具备上述弊病且均无相关物资检讨项等题目,国度药典委员会将其列为国度方剂准则提升处事,天津市方剂考验钻研院承当苯丙氨酯及其片剂原料准则的改正草拟处事,本文拟建设同时测定苯丙氨酯及片剂含量和相关物资的HPLC办法[4]。
1材料
LC-20A型高效液相色谱仪①;型高效液相色谱仪②;AE-型电子天平(瑞士MettlerToledo公司);ASA型超声仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。
苯丙氨酯比较品;苯丙氨酯(东港市某公司供应,批号:、170、);苯丙氨酯片(规格:mg,由天津某药厂供应,批号:、、P);甲醇为色谱纯,水为纯化水。
2办法与后果
2.1色谱前提
色谱柱:①PhenomenexLunaC18柱(4.6mm×mm,5μm);②AgilentEclipseXDB-C18柱(4.6mm×mm,5μm);③DikmaDiamonsilC18柱(4.6mm×mm,5μm);除片剂相关物资空白辅料影响实验和耐用性实验外,其余实验均采取仪器①和色谱柱①;崎岖相为甲醇-水(60∶40);探测波长为nm;柱温40℃;流速1.0mL·min-1,进样量20μL。
2.2溶液的制备
2.2.1供试品溶液a(相关物资)
取本品材料约50mg(或相当于苯丙氨酯约50mg的片粉),周详称定,置50mL量瓶中,加崎岖相熔解并稀释至刻度,摇匀(片剂溶液滤事后取续滤液)(1.0mg·mL-1)。
2.2.2比较溶液(相关物资)
周详量取“2.2.1”项下供试品溶液a1mL,置mL量瓶中,用崎岖相稀释至刻度,摇匀,即得。
2.2.3麻利度测试溶液
周详量取“2.2.2”项下比较溶液1mL,置20mL量瓶中,用崎岖相稀释至刻度,摇匀,即得。
2.2.4空白辅料溶液
按天津某药厂供应的处方比例,照供试品溶液a配制办法配制不含主成份的辅料溶液。
2.2.5供试品溶液b(含量测定)
取本品材料约50mg(或相当于苯丙氨酯约50mg的片粉),周详称定,置mL量瓶中,加崎岖相熔解并稀释至刻度,摇匀(片剂溶液过滤后取续滤液),周详量取5mL,置50mL量瓶中,用崎岖相稀释至刻度,摇匀(50μg·mL-1)。
2.2.6比较品溶液(含量测定)
周详称取苯丙氨酯比较品适当,加崎岖相熔解并定量稀释制成50μg·mL-1的溶液,摇匀,即得。
2.2.7专属性实验储存液
周详称取材料药(或片粉)适当,加崎岖相熔解并定量稀释制成10mg·mL-1的溶液,摇匀,即得。
2.3系统合用性实验
取比较品溶液进样测试,按苯丙氨酯峰筹划理论板数为,拖尾因子为1.1。按“2.1”项下进样、测定、纪录色谱图。比较品溶液、供试品溶液a、b及空白溶剂的色谱图见图1,主峰与相邻杂质峰的离别度>1.5。
2.4专属性实验
2.4.1摧残实验
取“2.2.7”项下专属性实验储存液各5份,每份1mL,离别实行如下解决。(1)酸摧残:加盐酸溶液1mL,振摇30min后,用氢氧化钠试液调pH为中性,加崎岖相稀释至10mL(片粉溶液需过滤,如下同);(2)碱摧残:加氢氧化钠试液1mL,振摇30min后,用1mol·L-1盐酸溶液调pH为中性,加崎岖相稀释至10mL;(3)氧化摧残:加30%过氧化氢溶液1mL,开水浴中加热15min,放冷至室温,用崎岖相稀释至10mL;(4)光照摧残:光照7d,加崎岖相稀释至10mL;(5)热摧残:加崎岖相适当,开水浴中加热1h,放冷至室温,加崎岖相稀释至10mL。离别取上述溶液20μL,按“2.1”项下的色谱前提进样、测定,纪录色谱图至主成份峰保存光阴的4倍,详见图2。后果声明:在上述前提下,材料及片剂供试品溶液在酸、碱、光、热的摧残前提下根本褂讪,均未见显然补充的杂质色谱峰,在氧化加热的前提下形成降解杂质,各杂质峰之间、与主峰之间根本可抵达基线离别,申明制定的色谱前提专属性精良。
A.空白溶剂(blanksolution)B.比较品溶液(referencesolution)C.供试品溶液b(samplesolutionb)D.供试品溶液a(samplesolutiona)1.苯丙氨酯(phenprobamate)
图1高效液相色谱图
2.4.2辅料做梗实验
取“2.2.4”项下空白辅料溶液20μL,离别采取如下三种色谱前提,即色谱前提A:仪器①色谱柱①;B:仪器①色谱柱②;C:仪器②色谱柱③,其余按“2.1”项下的色谱前提,进样,纪录色谱图,后果显示,在上述色谱前提下,主峰的相对保存光阴为0.4以前均形成多少辅料峰,保存光阴最大的辅料峰的相对保存光阴均为0.4,按本身比较法筹划,总辅料量约为0.5%。材料及片剂共6批样本在辅料峰处均未检出杂质色谱峰,且专属性实验的各类摧残前提下亦未在辅料峰处检出显然补充的降解产品峰,故在原料准则中扣除主峰相对保存光阴为0.4以前的色谱峰,以去除辅料对片剂相关物资测定的影响。
2.5线性关连观察
周详称取苯丙氨酯比较品适当,用崎岖相熔解并稀释制成含苯丙氨酯0.5、1、2、5、10、20的系列浓度溶液(相关物资)和12.5、25、50、75和μg·mL-1的系列浓度溶液(含量测定),离别取20μL,按“2.1”项下前提进样、测定、纪录色谱图。以峰面积(Y)对浓度(X)实行线性回归。(相关物资)和(含量测定)线性方程离别为:
Y=X+39.88r=0.
Y=X+.3r=0.
后果声明:苯丙氨酯在0.51~30.24μg·mL-1和12.60~.82μg·mL-1的浓度规模内与其峰面积均呈精良线性关连。
2.6探测限与定量限
取苯丙氨酯比较品适当,采取逐渐稀释法配制系列浓度的溶液,按“2.1”项下前提进样、测定、纪录色谱图。主成份峰信噪比S/N=10时,以此做为麻利度测试溶液(0.05%),最低定量限为10ng;信噪比S/N=3时,最低检出限为4ng。
2.7周详度实验
取含量测定比较品溶液赓续进样6次,苯丙氨酯峰面积的RSD=0.2%,声明本系统周详度精良。
2.8褂讪性实验
取材料供试品溶液a和b,离别于室温下安顿0、2、8、12、24h时进样测定。供试品溶液a苯丙氨酯峰面积的RSD离别为0.4%(材料)和0.3%(片剂);供试品溶液b苯丙氨酯峰面积的RSD离别为0.8%(材料)和0.5%(片剂)。后果声明相关物资及含量测定供试品溶液均在24h内根本褂讪。
A.空白溶剂(blanksolution)B.材料供试液(phenprobamatesolution)C.材料酸/碱/高温/光照摧残(phenprobamatedestroyedbyacid/alkali/heat/light)D.材料氧化摧残(phenprobamatedestroyedbyoxidation)E.片剂辅料溶液(excipientsolution)F.片剂供试液(phenprobamatetabletstestsolution)G.片剂酸/碱/高温/光照摧残(phenprobamatetabletsdestroyedbyacid/alkali/heat/light)H.片剂氧化摧残(phenprobamatetabletsdestroyedbyoxidation)1.苯丙氨酯(phenprobamate)
图2专属性实验高效液相色谱图
2.9反复性实验
取苯丙氨酯材料,离别按“2.2.1”和“2.2.5”制备供试品溶液a和b各6份,离别按“2.1”项下前提进样、测定、纪录色谱图。检出相关物资单个最大杂质和杂质总量后果根本一致;含量测定后果RSD=0.2%,声明办法反复性好。
2.10片剂回收率实验
称取空白全辅料约0.25片量,共9份,离别置mL量瓶中,周详插手比较品约40、50和60mg各3份,加崎岖相适当,振摇使熔解后用崎岖相稀释至刻度,摇匀,滤过,周详量取续滤液5mL,置50mL量瓶中,用崎岖相稀释至刻度,摇匀,离别按“2.1”项下前提进样、测定、纪录色谱图。筹划均匀回收率为99.7%,RSD=0.6%(n=9),声明办法确切度精良。
2.11耐用性实验
按“2.4.2”项下的三种色谱前提,离别对苯丙氨酯材料及片剂实行相关物资和含量的测定,测定后果根本一致(见表1),声明本办法的耐用性精良。
2.12样本测定
2.12.1主药含量测定
取材料药及片剂各3批,按“2.2.5”项和“2.2.6”项下办法制备,取供试品溶液和比较品溶液各20μL注入液相色谱仪,纪录色谱图,按外标法筹划含量,后果见表1。
2.12.2相关物资测定
取材料药及片剂各3批,按“2.2.1”项下办法制备,取供试品溶液和比较溶液各20μL注入液相色谱仪,纪录色谱图至主成份峰保存光阴的2倍,按主成份本身比较法筹划杂质含量,后果见表1。
3商议
3.1供试液浓度的取舍[5]
以甲醇-水(60∶40)为崎岖相,首先按含量测定供试液浓度为0.5mg·mL-1、相关物资供试液浓度为2.5mg·mL-1或5mg·mL-1、以1%的稀释溶液为本身比较实行观察,采取仪器①和上述3支色谱柱。后果显示,高浓度供试液(2.5mg·mL-1和5mg·mL-1)色谱图中,主成份色谱峰的峰形错的称、拖尾严峻,拖尾因子在3支色谱柱上均为1.3~1.4。经调换崎岖相构成及比例亦不能有用革新该色谱峰的对称性。将相关物资供试液浓度调换为1.0mg·mL-1,含量测定供试液浓度调换为50μg·mL-1,以10μg·mL-1的溶液做为1%的本身比较溶液,上述浓度的溶液在3支色谱柱上均峰形对称性精良(拖尾因子≤1.2),以0.5μg·mL-1的溶液做为麻利度测试溶液(相当于0.05%),主成份峰信噪比均>10,能够知足测定请求。
3.2探测波长的取舍
取浓度为1.0mg·mL-1的供试液在~nm波长规模内扫紫外图谱,显示本品的最大摄取波长为nm;在上述液相色谱前提下苯丙氨酯的最大摄取波长亦为nm,故断定以nm做为测定波长。
3.3测按光阴的取舍
凭借专属性实验的色谱图及6批样本相关物资的测定图谱,在纪录色谱图至主成份峰保存光阴的2倍~4倍时,均未检出杂质色谱峰,故断定色谱图的纪录光阴为主成份峰保存光阴的2倍。
3.4与原准则测定办法的比较
本钻研建设的RP-HPLC法较氮测定法职掌更为简洁;较紫外分光光度法可防止蒸发性溶剂所带来的过错,使测定后果更为确切。其它,现行准则均未遏制杂质含量,难以保证用药平安,而本钻研建设的相关物资测定办法麻利度高,能够确切测定杂质含量。
3.5小结
本办法简洁、确切,专属性好,麻利度高,可用于苯丙氨酯及其片剂的原料遏制。
参考文件
[1]苏聪娟,黄占周,于林怡,等.苯丙氨酯药理毒理和临床钻研综述.临床正当用药,,5(12A):
SUCJ,HUANGZZ,YULY,etal.Areviewofpharmacotoxicologyandclinicalstudiesofphenylalanine.ChinJClinRationDrugUse,,5(12A):
[2]中华国民共和国药典年版.二部.:
ChP.VolⅡ.:
[3]国度方剂准则·化学方剂场合准则高涨国度准则.第十四册.3:32
NationalDrugStandards:NationalStandardsforChemicalsPromotedfromLocalStandards.Vol14.3:32
[4]谢沐风.何如建设高效液相色谱法测定相关物资的办法.华夏医药产业杂志,7,38(1):45
XIEMF.HowtoestablishaHPLCmethodfordeterminationofrelatedsubstancesindrugs.ChinJPharm,7,38(1):45
[5]谢沐风.高效液相色谱法测定含量时对于创办色谱前提与溶液浓度的商议.华夏方剂准则,8,9(4):
XIEMF.DiscussionaboutchromatographicconditionsandsolutionconcentrationincontentdeterminationbyHPLC.DrugStandChina,8,9(4):
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