1.培养基配制注意事项
植物组织培养最常用MS培养基，包含十几种化合物。有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，所以MS培养基需要配制多种高倍母液。
配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分；切记一锅煮，即不能将各种化合物一齐添加进去。
2.灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软
植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感，pH值低于5很难成胶或凝胶偏软，切记高压灭菌前调节培养基pH值（5.5-6.0）。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求，也就是相对于MS培养基，1/2MS培养基中植物凝胶要适当增加用量。
另外灭菌后，倒出培养基前一定将培养基摇匀（带防烫手套），因为琼脂密度大底层含量高，容易造成培养基强度不均匀。
3.水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用过程中有无区别？
水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量在mg/L，不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，酶解更有利于发挥其作用。
4.怎么溶解组培常用植物激素？
IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量95%的乙醇中，再加水定容配制成母液。
如有结晶析出，可考虑用1/10体积的乙醇溶解后再定容；2，4-D易溶于碱性水溶液，可用少量1mol/L的NaOH溶液溶解后再慢慢加水定容；KT和6-BA先用少量的HCL溶解，再加水定容到一定的浓度。
5.细胞分裂素使用浓度？
一般情况下在培养基中加入0.1～10.0mg/L的细胞分裂素（6-BA/KT/ZT)，多数用1.0～2.0mg/L，KT浓度为0.5～2mg/L，浓度要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。
6.哪些植物激素能高压灭菌，哪些不能高压灭菌？
IBA、NAA、6-BA、2,4-D可高温高压灭菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌，否则会分解失效，该类植物激素配制母液后需用0.22微孔滤膜过滤除菌，待培养基冷却（50-60℃）后尚未凝胶前加入混匀。
7.培养基的pH值会凝胶硬度有无影响？
有影响。
若将培养基pH值调的过高（大于6），则培养基偏硬，增加接种的阻力，会对外植体造成损伤。
若将培养基pH值调的过低（小于4.5），则培养基不能凝固，起不到固定外植体的作用。一般将培养基的pH调节至5.5～6.0为宜。
8.灭菌过程是否影响培养基的pH值？
培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化，培养基pH值灭菌后会有所下降，灭菌前培养基的pH值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。
9.应用75%的酒精进行种子消毒的过程中需要注意哪些问题？
种子在消毒过程中使用75%的酒精应慎重，酒精渗透力极强，消毒时间过长会直接影响种子发芽率，所以建议消毒时间不应超过1min。
10.原始繁殖材料的消毒
组培原始繁殖的外植体消毒，直接影响整个培养过程。
从室外采回来的外植体需进行消毒，首先用自来水冲洗外植体，冲洗时间可根据采集部位不同而定，一般在5～15分钟即可；在超净台中进行药剂的处理，常用的药剂处理有70%的乙醇溶液、9%的次氯酸钠溶液和0.1～0.2%的升汞溶液，具体可根据实验材料而定。应注意的是经升汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗6～8次。
11.怎样处理植物组织培养过程中出现的各种污染？
植物组织培养过程中的污染来源主要分为3种：真菌、细菌、组织培养过程中的污染源
在操作过程中，难免有菌落入培养基或植物材料上导致污染。不正确操作也会增加污染几率。
预防措施：通风、保持室内空气干燥、紫外杀菌等。污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。
污染原因判断：
（1）培养基污染
若污染菌类是零星分散在培养基中，可确定是人为引起的污染。比如：培养基灭菌不彻底，开瓶时间过长，灭菌后存放时间过长，高温蒸汽灭菌器的温度、压力、时间没有正确设，过滤灭菌过程中滤膜孔径选择，过滤灭菌器的灭菌处理，过滤灭菌操作等。这些均会影响培养基的灭菌效果。
措施：严格按照实验要求，灭菌规程操作。
（2）外植体污染
若污染菌类是从材料周围长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；
若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因可能是未剪去两个切口或者虽剪去切口但是所用器具带菌；或者是未及时发现污染苗，接种过程中引起交叉污染；
措施：取材时应仔细选择，以减少污染的发生。
（3）操作环节污染
接种室是否清洁、干燥、密封，是否经常用紫外灯照射、甲醛熏蒸、70%的酒精喷雾杀菌等；超净工作台摆放物品杂乱，长时间不换滤网，导致净化能力降低；接种用具灭菌不彻底引起污染；操作不正确等。
措施：每次接种前半个小时，用20%的新洁尔擦洗室内设备、工作台面，再用紫外灯照射20min，喷洒70%的乙醇进行消毒。除了培养基、接种材料、器具和用具保证无菌外，同时在接种时还需要严格进行无菌操作。
（1）真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉；若是细菌污染，只要及时发现，将材料上部未感染菌的部分剪下转接，材料仍可以用。
（2）用抗生素等杀菌药剂处理。至今还未发现哪种抗生素能够对各种菌都有效，并且常影响植物材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。
12.外植体的选择
为了使接种后的诱导得以成功，选择的外植体应该是幼嫩、处于生长旺盛时期的，选择的外植体的体积不能过小，如若过小则会影响愈伤组织的形成，从而影响进一步的分化。因此，一般接种的外植体体积在0.5～1.0cm2的范围内即可。最适的为茎尖、带芽、茎段，也可以利用叶子、子叶、根段、花器官组织等。
13.植物茎段组织培养需要注意哪些问题
以茎段进行组织培养比较容易，一般取植物的嫩茎切段作为外植体，切成0.5～1cm长的小段进行接种，保证每个茎段有一个芽点和一片叶子，将芽点部位以下垂直插入培养基凝胶中进行生根培养。
14.外植体接种需要注意的操作事项
接种前首先进行灭菌消毒，接种所用的镊子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高温高压灭菌，提前10分钟打开超净工作台，灭紫外15～20min，操作人员要用75%的酒精棉球擦手、工作台和器皿，解剖刀和镊子等随时擦酒精灼烧，晾凉后备用。
在无菌培养皿或滤纸上切割外植体，接种到培养基表面，注意瓶口倾斜接近酒精灯火焰。
15.组织培养中材料褐化现象
不同品种以及生理状态引起的褐化状态不同。培养基过高浓度的无机盐及高水平细胞分裂素会使褐化现象加重。培养条件不当，例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加重外植体的褐变程度。
防治措施：
选择合适的外植体：选择生长处于旺盛的外植体，可以使褐变现象明显减轻。
合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0.1%～0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
连续转移：对容易褐变的材料可间隔12～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
16.材料玻璃化问题
植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明、水迹状，这种现象通常称为玻璃化。
玻璃化为试管苗的生理失调症，试管苗生长缓慢、玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，繁殖系数有所下降。当培养基上细胞分裂素水平较高时，容易出现玻璃化现象。
愈伤组织的玻璃化问题主要表现在培养过程中愈伤组织松散、脆易碎。叶子或是长出的愈伤一段时间后在其周围出现水渍化，继而影响整个培养基。
防治措施:
在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，降低培养基中细胞分裂素含量及含氮化合物的用量，选用低NH4+水平的B5培养基，都能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生；
增加光照，对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；在培养基中添加活性炭、马铃薯汁、间苯三酚等可有效的减轻和防止玻璃化。
17.材料水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯
可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。
改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。
18.材料长期培养几乎无反应
可能原因：培养基不适合，生长素的选择和用量不当，植物激素对生长发育和生理过程的调节作用，往往不是某一种植物激素的单独效果；环境温度不适宜。
改进措施：
更换培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度；
调整激素的种类与配比，增加生长素用量，例如使用人工合成的生长素类似物2，4-D等可有效促进细胞分裂和伸长，新器官的分化和形成；
调整培养温度等环境条件。
19.愈伤组织生长过旺疏松
可能原因：由于培养基中激素添加过量，培养室温度偏高，矿物质等无机盐含量不当等因素引起的。
改进措施：根据不同的品种、不同组织、不同器官，应适当减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度，避免愈伤组织生长过旺和疏松现象发生。
20.愈伤组织生长缓慢太紧密
可能原因：细胞分裂素和生长素的用量过多，糖浓度过高。
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。
21.愈伤组织分化率低，畸形，分化出的芽多为叶状芽或丛芽，芽生长困难，不易成苗。培养时间长时，再次愈伤组织化
可能原因：生长素用量偏高，温度偏高。
改进措施：减少生长素用量，可以通过分化培养时在培养基中添加GA3（浓度在0.5～2mg/L之间）解决，并适当降低愈伤组织的培养温度。
22.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽
可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，产生过多的不定芽；温度过高，光照短，光强不足；不及时的转移和分切，生长空间小。
改进措施：
减少细胞分裂素用量，免用赤霉素；
延长光照时间，增强光照；
及时转接；
降低接种密度；
更换透气的封口膜等。
23.组织培养过程中出现黄化
可能原因：培养基中Fe的含量不足，各种矿质营养不均衡；培养环境通气不良，瓶内有害气体积累（乙烯、氨气、甲醛）等会引起植物材料黄化脱落；激素配比不当；糖用量不足或长时间不转移；pH值变化过大；培养温度不适；光照不足等。
改进措施：
改善组培条件，在配制培养基过程中检查仪器设备是否准确；
降低组培苗的接种密度，及时转接培养物；
使用透气的封口膜改善瓶内通气状况；
适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度；
控制培养室内温度，适当增加光照。
24.植物组培培养基都有哪些？
MS培养基：年穆拉辛格和斯库格为烟草细胞培养而设计，其中硝酸盐的浓度高，适合植物原生质体、细胞和组织培养。
B5培养基：年甘伯尔格为大豆细胞培养而设计，铵的浓度低。适合木本植物的组织和细胞培养。
富盐平衡培养基：是目前使用最广泛的一类，特点是：无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高；元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。
高硝态氮培养基：代表性培养基有B5、N6、SH。特点是：硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（VB1）。
中盐培养基：大多是在MS培养基基础上进行改良设计。特点是：大量元素无机盐为MS的一半，微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比MS增多，例如增加了生物素、叶酸等。
低盐培养基：无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基。
25.木本植物（油料植物）组织培养中遇到再生苗无法生根时怎么办？
一般常用的1/2MS或者1/2WPM基本能够满足。如果增殖用的都生产正常，到生根的时候出现落叶，只能通过排除法一样样分析。
首先看是不是培养温度太高，使用瓶盖后透气性差，导致乙烯积累。其次，可以适当添加少量分裂素，或者更换生长素，以及多种生长素混合使用。
26.培养基中添加糖类作为碳源物质，有何重要作用？
碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖。采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。
生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。
27.用于植物原生质体制备的材料，以及常用的渗透压调节剂
用于植物原生质体的材料需要选取生长旺盛的细胞，幼嫩的组织。无菌试管苗的叶片、胚轴及子叶、花药，以及愈伤组织（悬浮细胞）等。
常用的调节原生质体渗透压的稳定剂主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。渗透压浓度一般为0.3～0.8mol/L。
28.组培苗移栽需要注意的问题
在移栽前打开三角瓶的封口膜，炼苗3～5d后取出小苗，用流水洗净根部的培养基，然后移栽到盛有灭过菌的蛭石营养钵中过度一下，但要注意不可直接向营养钵中浇营养液（容易长菌），用透明的塑料薄膜罩住小苗3～5d后移栽到土里。
29.光照强度多少lux是如何计算的
光照强度=光通量/单位面积。Lux的换算比较抽象，一般以烛光为计算单位，现在所用的以电源发光的光源，记作国际烛光，即25瓦特的电灯其光强度等于25国际烛光。1标准烛光=10.76Lux。
30.LED光源在植物组织培养中的选择
光是植物生长中最重要的环境因子之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED光源nm左右的蓝光和nm左右的红光是植物最需要的光波，对植物的生长发育起着关键性的作用。
植物组织培养/微繁殖（micropropagation）大体上可以划分为5个阶段，这样的阶段划分不仅是对组培流程的描述，也代表了需要对培养条件进行改变的关键节点。
零阶段
母本的选择和处理(Stage0Motherplantselectionadnpreparation)。在组培实验开始前，必须慎重选择母本材料。母本的品种/物种特性要典型，没有任何病害迹象。需要考虑对母本材料进行一定处理，以降低stage1的外植体污染率。适当的环境条件或化学试剂处理有可能提升后续组培阶段的生长、形态发生和增殖率，例如一定的高温处理、细胞分裂素和/或赤霉素的喷施。对母本可能携带的细菌和病毒进行检测是商业化植物组织培养的必要环节，但常常被忽略了。
第一阶段无菌培养体系的建立
（StageⅠEstablishinganasepticculture)
本阶段主要是建立起外植体的无菌培养体系。成功的标志是外植体没有微生物污染，并且有一定的生长，例如茎尖的生长或愈伤组织的形成。本阶段通常会有大量的外植体接种，经过短期培养应该将有污染出现的培养容器丢弃掉，不再继续培养。本阶段只要获得目标数量的无污染，其表现生长的外植体即可，不需要%的成功率。
第二阶段繁殖体的增殖
（StageⅡtheproductionofsuitablepopagules)
本阶段主要目标是扩增繁殖体的数量。例如，侧芽的生长，不定芽的产生，体细胞胚的形成和微型储藏器官（块茎和鳞茎）的形成。本阶段产生的繁殖体通常再次进入增殖循环中，以扩增到需要的数量。
第三阶段移栽前培养
（StageⅢPreparationforgrowthinthenaturalenviroment)
StageⅡ产生的小苗或者芽（shoots）通常不具备在基质中自主生长的能力。在stageⅢ，需要通过一些培养措施使得这些小苗产生足够的光合能力。有些植物需要在stageⅢ进行特殊处理以避免生长停滞或休眠。
生根培养是stageⅢ的重要工作。通常需要将芽转入生根培养基中进行生根。有的情况下，在生根培养前，需要将芽培养到足够的长度。为了降低成本，有很多实验室会将未生根的芽转出组培瓶外进行生根培养。
第四阶段移栽驯化
（StageⅣTransfertothenaturalenviroment)
本阶段为组培苗从组培瓶转入温室驯化培养。本阶段至关重要，如果操作不当，会造成大量损失。主要的原因有两个：
1.组培苗容易失水死亡。组培苗通常在高湿度和低光强条件下培养，叶片表面的蜡质未形成。组培苗的气孔在遇到湿度降低时可能不会闭合。以上原因会导致组培苗在移栽后迅速失水死亡。
2.组培苗以蔗糖为碳源且处于低光强下，光合能力较弱。如果在移栽后短时间内不能形成光合能力，也会出现死亡。
通常组培苗从组培容器中取出后需要洗净根上的琼脂，转入移栽基质中。在驯化早期，需要高湿度和低光强的条件，随后逐渐减低湿度和增加光强，直到适应温室环境。
植物组织培养的阶段划分最早是Murashige教授提出的三阶段划分（即stageⅠ，Ⅱ和Ⅲ），这一划分方案也被广泛的认同和采用。后续stage0和stageⅣ的增加使得这个体系更加完整。按照这个阶段划分去设计和优化组培方案，对实际工作是有帮助的。
植物组织培养的条件
1、植物组织培养的整个操作和培养过程都要求在严格无菌条件下进行，无菌是组织培养成功的首要条件。操作过程在接种室内超净工作台上进行；外植体材料要进行表面消毒；配制的培养基要进行高压灭菌消毒。
2、温度处理操作和培养过程都是在恒温条件下进行，一般在23—27℃之间，热带植物可偏高些，脱毒植物需要高温处理。
3、光照处理植物的器官必须有光，某些植物器官的生成是在无光条件下，但它的生长和发育必须有光。茎尖的生长及试管苗的继代增殖以-0lux光照强度适宜；生根试管苗以lux适宜。光质对愈伤组织诱导、增殖、器官的分化有不同的影响。光周期诱导一般是16h，黑暗是12h，对光周期敏感植物要掌握光照时间，否则影响植物的分化。
培养基的酸碱度因植物的种类不同而有区别，大多数植物要求在5.8之间，喜酸性培养的植物要求的酸碱度较严格。
组培应用前景
1．快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物，依靠自然条件在较短时间内繁殖稀有植物和经济价值较高的植物，受到地理环境和季节的限制，很难达到快速、高效的目的；特别对于在短时期内需要达到一定数量，才能创造应有价值的植物，时间就是效益，只有通过组织培养的方法才能满足这一要求。
用组织培养法繁殖植物，这是组织培养应用于生产的主要的和成效最大的实例。首先是在兰花上的成功应用。自Morel在年得到兰花组织培养苗后，很快应用于生产，形成了组织培养法繁殖兰花工业。
由于组织培养法繁殖植物的明显特点是快速，每年可以数以百万倍速度繁殖，因此对一些繁殖系数低，不能用种子繁殖的名特优植物品种的繁殖，尤为意义重大。
2、脱毒植物中有很多都带有病毒，严重影响植物的产量和品质，给农业带来灾害。特别是无性繁殖植物，如马铃薯、草莓、大蒜、康乃馨等，由于病毒是通过维管束传导的，因此利用这些植物营养器官繁殖，就会把病毒带到新的植物个体上而发生病害。但是也证明感病植株并不是每个部位都带有病毒，如茎尖生长点尚未分化成维管束的部分，可能不带病毒。若利用组织培养法进行茎尖培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒的苗，再用这种苗进行繁殖，则种植的植物就不会或极少发生病毒病。
所获得的脱毒苗一定要经过鉴定，确认不带病毒才能使用。使用组织培养法获得脱毒苗已经在草莓、葡萄、康乃馨等获得成功，产生明显的经济效应。
3、植物种质资源的保存、挽救濒于灭绝的植物长期以来人们想了很多方法来保存植物，如储存果实，储存种子，储存块根、块茎、种球、鳞茎；用常温、低温、变温、低氧、充惰性气体等，这些方法在一定程度上收到了好的或比较好的效果，但仍存在许多问题。主要问题是付出的代价高，占的空间大，保存时间短，而且易受环境条件的限制。植物组织培养结合超低温保存技术，可以给植物种质保存带来一次大的飞跃。因为保存一个细胞就相当于保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一，而且在-度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。
环境的不断变化使许多种类的植物面临着灭绝的危险，而且许多种植物已经灭绝，留给人类的只是一种遗憾。如何挽救这些植物，还有许许多多的动物，已成为世人
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