保健食品原料目录螺旋藻及原料技术要求

《保健食品原料目录螺旋藻》

螺旋藻原料技术要求

螺旋藻为钝顶螺旋藻（Arthrospiraplatensis）和极大螺旋藻（Arthrospiramaxima）经人工培养、采收、清洗的藻泥，经过喷雾干燥，或者其他干燥方法并经杀菌获得的干粉。

应符合表1规定。

表1感官指标

取少量样品于水中，充分震荡搅拌使藻粉颗粒分散，显微镜视野中应呈分散、绿色的S形、L形、C形或螺旋形的藻丝体，不得有明显异物。

应符合表2规定。

表2理化指标

应符合表3规定。

表3微生物指标

注：n为同一批次产品应采集的样品件数；c为最大可允许超出m值的样品数；m为致病菌指标可接受水平的限量值；M为致病菌指标的最高安全限量值。

应符合表4规定。

表4标志性成分指标

1β-胡萝卜素的测定

1.1试剂和材料

1.1.1氢氧化钾溶液:称固体氢氧化钾g,加入mL水溶解。临用前配制。

1.1.2无水硫酸钠(Na2SO4)，分析纯

1.1.3抗坏血酸(C6H8O6)，分析纯

1.1.4石油醚：沸程30℃~60℃，分析纯

1.1.5甲醇(CH4O)，色谱纯

1.1.6乙腈(C2H3N)，色谱纯

1.1.7甲基叔丁基醚[CH3OC(CH3)3]，色谱纯

1.1.8二氯甲烷(CH2Cl2)，色谱纯

1.1.9无水乙醇(C2H6O)，优级纯

1.1.10水，符合GB/T规定的一级水

1.1.11碘溶液(I2):0.5mol/L浓度

1.1.,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(C15H24O，BHT)

1.2仪器和设备

1.2.1匀浆机

1.2.2高速粉碎机

1.2.3恒温振荡水浴箱（控温精度±1℃）

1.2.4旋转蒸发器

1.2.5氮吹仪

1.2.6紫外-可见光分光光度计

1.2.7高效液相色谱仪(带紫外检测器)

1.3对照品溶液制备

1.3.1β-胡萝卜素标准储备液(μg/mL)

准确称取β-胡萝卜素标准品25mg(精确到0.1mg)，加入0.gBHT，用二氯甲烷溶解，转移至50mL棕色容量瓶中定容至刻度。

1.3.2β-胡萝卜素标准中间液(μg/mL)

从β-胡萝卜素标准储备液中准确移取10.0mL溶液于50mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。

1.3.3β-胡萝卜素标准工作液

从β-胡萝卜素标准中间液中分别准确移取0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、10.00mL溶液至6个mL棕色容量瓶。用二氯甲烷定容至刻度，得到浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、10μg/mL的系列标准工作液。

1.3.4碘乙醇溶液(0.05mol/L)

吸取5mL碘溶液,用乙醇稀释至50mL,混匀。

1.3.5异构化β-胡萝卜素溶液

取10mLβ-胡萝卜素标准储备液于烧杯中，加入20μL碘乙醇溶液，摇匀后于日光下或距离40W日光灯30cm处照射15min，用二氯甲烷稀释至50mL。摇匀后过0.45μm滤膜，备HPLC色谱分析用。

1.4供试品溶液制备

1.4.1预处理

精确称取1g~5g(精确至0.g)螺旋藻粉，转至mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸、75mL无水乙醇，于60℃±1℃水浴振荡30min。

1.4.2皂化

加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，皂化30min。取出，静置，冷却到室温。

1.4.3试样萃取

将皂化液转入mL分液漏斗中，加入mL石油醚，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡，10min后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。合并有机相，用水洗至近中性。弃水相，有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入mL蒸发瓶中，于旋转蒸发器上40℃±2℃减压浓缩，近干。用氮气吹干，用移液管准确加入5.0mL二氯甲烷，盖上瓶塞，充分溶解提取物。经0.45μm膜过滤后，弃出初始约1mL滤液后收集至进样瓶中，备用。

1.5色谱条件

a)色谱柱：C30柱，柱长mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；

b)流动相：A相：甲醇:乙腈:水=73.5:24.5:2；

B相：甲基叔丁基醚；

表5梯度程序

c)流速：1.0mL/min；

d)检测波长：nm；

e)柱温：30℃±1℃；

f)进样体积：20μL。

1.6测定

在相同色谱条件下,将待测液注入液相色谱仪中,以保留时间定性,根据峰面积采用外标法定量,β-胡萝卜素根据全反式β-胡萝卜素响应因子进行计算。

1.7全反式β-胡萝卜素色谱纯度的计算

1.7.1β-胡萝卜素异构体保留时间的确认

分别取β-胡萝卜素标准中间液(μg/mL)和异构化β-胡萝卜素溶液,按照色谱条件注入HPLC仪进行色谱分析。根据β-胡萝卜素标准中间液的色谱图确认全反式β-胡萝卜素的保留时间；对比β-胡萝卜素标准中间液和异构化β-胡萝卜素溶液色谱图中各峰面积变化，以及与全反式β-胡萝卜素的位置关系确认顺式β-胡萝卜素异构体的保留时间：全反式β-胡萝卜素前较大的色谱峰为13-顺式-β-胡萝卜素，紧邻全反式β-胡萝卜素后较大的色谱峰为9-顺式-β-胡萝卜素，13-顺式-β-胡萝卜素前是15-顺式-β-胡萝卜素，另外可能还有其他较小的顺式结构色谱峰，色谱图见图。

1.7.2全反式β反胡萝卜素标准液色谱纯度的计算

取β-胡萝卜素标准工作液(3μg/mL),按照色谱条件进行HPLC分析,重复进样6次。计算全反式β-胡萝卜素色谱峰的峰面积、全反式与上述各顺式结构的峰面积总和,全反式β-胡萝卜素色谱纯度（CP）按公式计算。

CP———全反式β-胡萝卜素色谱纯度，%；

all-E———全反式β-胡萝卜素色谱峰峰面积平均值，单位为峰面积(AU)；

sum———全反式β-胡萝卜素及各顺式结构峰面积总和平均值,单位为峰面积(AU)。

1.8结果计算

计算全反式β-胡萝卜素响应因子

将β-胡萝卜素混合标准工作液注入HPLC仪中(色谱图见图1),根据保留时间定性,测定β-胡萝卜素各异构体峰面积。

β-胡萝卜素根据标准工作液标定浓度、全反式β-胡萝卜素6次测定峰面积平均值、全反式β-胡萝卜素色谱纯度（CP）,按公式计算全反式β-胡萝卜素响应因子。

式中:

RF———全反式β-胡萝卜素响应因子,单位为峰面积毫升每微克(AU·mL/μg)；

all-E———全反式β-胡萝卜素标准工作液色谱峰峰面积平均值，单位为峰面积(AU)；

ρ———β-胡萝卜素标准工作液标定浓度,单位为微克每毫升(μg/mL)；

CP———全反式β-胡萝卜素的色谱纯度，%。

试样中β-胡萝卜素含量按下公式计算:

式中:

Xβ———试样中β-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/g);

Aall-E———试样待测液中全反式β-胡萝卜素峰面积,单位为峰面积(AU);

A9Z———试样待测液中9-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

A13Z———试样待测液中13-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

1.2———13-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子;

A15Z———试样待测液中15-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

1.4———15-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子;

AxZ———试样待测液中其他顺式β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

V———试样液定容体积,单位为毫升(mL);

———将结果表示为微克每百克(μg/g)的系数;

RF———全反式β-胡萝卜素响应因子,单位为峰面积毫升每微克(AU·mL/μg);

m———试样质量,单位为克(g)。

注1:由于β-胡萝卜素各异构体百分吸光系数不同(见附录D),所以在β-胡萝卜素计算过程中,需采用相对校正因子对结果进行校正。

注2:如果试样中其他顺式β-胡萝卜素含量较低,可不进行计算。

1.9色谱图

图1β-胡萝卜素检测色谱图

说明：

Ⅰ——15-顺式-β-胡萝卜素；

Ⅱ——13-顺式-β-胡萝卜素；

Ⅲ——全反式α-胡萝卜素；

Ⅳ——全反式β-胡萝卜素；

Ⅴ——9-顺式-β-胡萝卜素。

2藻蓝蛋白的测定

2.1试剂

磷酸盐缓冲溶液:将0.1mol/L磷酸二氢钾溶液与0.1mol/L磷酸氢二钾溶液(45+55V/V)混合，溶液pH值为7.0。

2.2仪器和设备

2.2.1分光光度计

2.2.2超声波振荡器

2.2.3离心机（r/min）

2.2.4低温冰箱（-20℃）

2.2.5离心管（50mL）。

2.3供试品溶液制备

称取试样0.25-0.5g（精确至0.0g）。用缓冲液（2.1项）溶解，超声振荡5min.定容于mL容量瓶中，摇匀。将溶液全部转入mL广口塑料瓶，置于-20℃冰箱内冷冻12h(或放置过夜)。取出解冻，摇匀。

2.4测定

取部分溶液于离心管中，在r/min转速下离心15min取上层清液.1cm比色皿，在分光光度计上分别测定nm、nm、nm处的吸光度，用缓冲液(2.1项)做空白。

2.5结果计算

X1——测试液中藻蓝素的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

X2——测试液中异藻蓝素的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

X3——测试液中藻红素的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A——相应波长处(nm,nm,nm)测得吸光值；

X4——试样中藻蓝蛋白的质量分数，单位为克每克(g/g)；

V——样品定容体积，单位为毫升(mL)。

m——试样质量，单位为克(g)。

测定结果取平行试验结果的算术平均值，保留小数点后第二位。

平行试验允许误差(相对)不大于4%。

注2整个操作过程须注意避光，分光光度测定应在15min内完成。

包装应密封、牢固、防潮、不易破损，贮藏在遮荫、干燥、通风的库房内

片剂、颗粒剂、硬胶囊

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（信息来源：国家市场监督管理总局；编发：北京天健华成国际投资顾问有限公司保健食品注册部）