白藜芦醇的合成生物学制造技术项目通过

本报记者王薇

　　日前，中国轻工业联合会在湖南省津市市组织召开了“白藜芦醇的合成生物学制造技术”科技成果鉴定会。该项目由江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队和湖南鸿健生物科技有限公司共同完成。鉴定委员会专家听取了项目研究工作和技术报告，并审阅了相关鉴定资料，经质询与讨论后一致认为，“白藜芦醇的合成生物学制造技术”项目总体技术达到国际领先水平，研究成果将对应用合成生物技术生产天然产物起到积极的推动作用。

　　白藜芦醇是一种芪类多酚化合物，具有清除自由基、抗氧化、保护心血管等生理活性，在医药、功能食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。目前，白藜芦醇主要采用植物提取的方法制得，对自然植物资源依赖严重，而且受提取效率低等因素制约，成本较高、来源受限，无法满足日益增长的市场需求。随着合成生物技术的不断发展，在白藜芦醇等芪类化合物生物合成途径得到精确解析的基础上，利用微生物高效异源合成芪类化合物被寄予厚望。之前，国内外已有多个团队开展了天然酶挖掘、途径组装、代谢调控与发酵优化等方面的研究，但是产量一直较低，难以满足产业应用。

　　从目前来看，白藜芦醇主要还是从植物虎杖中提取。受环境因素影响，植物提取的产率低，无法满足全球的市场需求。根据FutureMarketInsights相关数据显示，白藜芦醇的市场规模约为万美元，预计从年到年将以8%—10%的复合年增长率增长。

　　虽然白藜芦醇拥有如此庞大的市场，但因植物提取率低、化学合成效率低以及微生物合成产量低等原因，使其无法满足市场要求，导致白藜芦醇的价格一直居高不下。以白藜芦醇在化妆品工业中的应用为例，尽管白藜芦醇是一种很有潜力的抗氧化剂，但由于其价格过于高昂，导致其下游终端产品的价格居高不下。

　　如何开辟新途径，开发成本更低的白藜芦醇生产技术，是解决这一问题的根本出路。为此，陈坚院士团队在国家重点研发计划项目、国家自然科学基金创新研究群体项目、国家自然科学基金优秀青年基金等项目的资助下，重点研究和开发了发酵法生产白藜芦醇的关键技术。

　　项目研究团队周景文教授在会上向专家组汇报研发工作情况时介绍，在前期研究工作的基础上，经过10年的艰苦工作，研究团队深入开展了白藜芦醇合成生物学制造的多项研究工作。

　　一是大肠杆菌中合成白藜芦醇的合成生物学制造初探。通过基因工程构建合成对香豆酸的重组大肠杆菌，建立针对于对香豆酸的高通量筛选模型，结合定向进化策略，提高了酪氨酸解氨酶的活性，对香豆酸产量提高了20%。通过模块化组装白藜芦醇途径，平衡丙二酸同化途径和白藜芦醇合成途径，实现了大肠杆菌中白藜芦醇的从头合成。这一结果为在模式微生物中结合基因工程改造策略和高通量筛选策略提高白藜芦醇合成效率提供了参考。

　　二是酿酒酵母中合成白藜芦醇的合成生物学制造。以模式真核生物酿酒酵母为出发菌株，通过代谢工程改造，增强前体供给，弱化旁路竞争途径。探究转运蛋白对香豆酸的积累影响，增强前体对香豆酸的积累。平衡糖异生途径与莽草酸途径，强化莽草酸途径相关基因，增强莽草酸通量，并对酪氨酸解氨酶进行区室化定位，实现前体对香豆酸的高效积累。最终，通过Ty转座随机整合4CL和STS相关基因，实现了白藜芦醇在酿酒酵母中最高可达88.37毫克/升的产量。这一结果为白藜芦醇在真核微生物中生产提供了思路，并展现出真核微生物比原核微生物更具有优势。

　　三是解脂亚洛酵母中代谢重构高效合成白藜芦醇。以非常规酵母解脂亚洛酵母为出发菌株，通过对不同白藜芦醇合成基因的筛选，强化莽草酸途径，融合表达香豆酰辅酶A连接酶和芪合成酶，协同表达酪氨酸解氨酶与苯丙氨酸解氨酶途径增加前体供给，最终将碳代谢流重新分布，实现了对香豆酸和白藜芦醇的高效积累。这些结果表明非常规酵母解脂亚洛酵母是白藜芦醇生产的优良宿主。以强化前体对香豆酸合成的解脂亚洛酵母为出发菌株，利用多拷贝整合工具整合关键限速步骤基因，结合强化丙二酰辅酶A的供给，实现了白藜芦醇的高效合成。

　　四是基于微生物生理特性研究的发酵过程优化。参考已知的生化反应计量关系，以及解脂亚洛酵母的代谢途径和生理代谢特征，通过发酵工艺优化使解脂亚洛酵母在发酵过程中处于酵母形态，实现了白藜芦醇的高产，为工业化生产奠定了基础。

　　五是白藜芦醇发酵工业规模放大及产品提取。在上述研究基础上，通过发酵过程优化控制策略，对解脂亚洛酵母高产白藜芦醇发酵过程逐级放大过程中的环境因素控制，成功实现工业放大发酵试验，产量、转化率和生产强度得到了进一步提升。使用可回收的溶剂提取发酵液中的白藜芦醇，并对工艺条件进行了系统优化，包括发酵液预处理、脱色剂筛选、萃取条件优化等，成功实现了白藜芦醇的高效分离和高纯度提取。

　　鉴定委员会认为，该项目通过在解脂亚洛酵母中进行合成基因筛选、莽草酸途径强化、中心碳代谢流重塑、关键基因表达强度优化、多拷贝整合工具构建、高产菌株高通量筛选等研究，构建了高效的白藜芦醇合成细胞工厂。在30吨发酵罐规模白藜芦醇产量、转化率和生产强度均达到国际水平，并实现了发酵法生产白藜芦醇的分离与高纯度提取。

　　专家指出，该项目对于实现用发酵法工业化生产白藜芦醇，打破国外公司对合成生物技术生产白藜芦醇的垄断，全面提升白藜芦醇发酵工业的技术水平，具有十分重要的现实意义，建议进一步加快项目技术的推广应用。