NanoDrop微量系统实用，高效的替代传统的核酸定量方法的使用是通过两个微量核酸定量协议的示范。
ABSTRACT
生物分子检测，不断地被开发使用的材料逐步数额较小，往往排除了使用传统的试管为基础的手段，为那些可以进行微量定量的核酸定量。
NanoDrop微量样品保留系统（ThermoScientific的NanoDrop产品）功能相结合光纤技术和自然表面张力特性，捕捉和保留微量的样品，独立于传统的遏制仪器，如试管或毛细血管。此外，该系统采用更短的路径长度，在一个广泛的核酸浓度测量的结果，从根本上消除了需要进行稀释。波谱分析所需的样本量的减少也有利于整个许多分子的工作流程纳入额外的质量控制步骤，提高效率，并最终导致下游的结果，以更大的信心。
有限质量高灵敏度荧光分析的需求也出现了与最近的实验进展。使用相同的微量样品保留技术，荧光测量可能与2μL材料，使荧光检测量的需求将大大减少。10μL或更少的这种microreactions现在可以使用一个专用的微量fluorospectrometer。
两个微量核酸定量协议将表明，使用集成的采样系统作为替代传统的试管为基础的协议的实际保留。首先，直接的A吸光度的方法，使用微量分光光度计描述。这是一个基于荧光的方法，使减少量的荧光反应，用微量fluorospectrometer示范。这些新技术使核酸的浓度从1pg/μL的15,纳克/μL样品消耗最小的评估。
PROTOCOL
1.使用NanoDrop2c分光光度计进行微量核酸定量
首先，通过将2至3μL干净的去离子水吸移到下部光学表面上，清洁微量分光光度计样品保留系统的上部和下部光学表面。关闭杠杆臂，确保上部基座与去离子水接触。提起杠杆臂，用干净，干燥，不起毛的实验室擦拭布擦拭光学表面。打开NanoDrop软件并选择NucleicAcid应用程序。使用小体积校准的移液器通过在下部光学表面上分配1μL缓冲液来执行空白测量。降低杠杆臂并在核酸应用中选择“空白”。完成空白测量后，使用干净，干燥，不起毛的实验室擦拭物清洁两个光学表面。为要测量的样品选择适当的常数。样品类型选择选项常数用于计算浓度双链DNADNA-单链DNADNA-RNARNA-寡习惯15-表1.使用NanoDrop微量体积分光光度计，与TrayCell微池比色皿一起使用的传统的基于比色皿的分光光度计，以及与PicoGreen测定结合的微量体积NanoDrop荧光分光光度计，直接A吸光度测量的典型核酸浓度范围。将1μL核酸样品分配到下部光学基座上并关闭杠杆臂。由于测量与体积无关，因此样品仅需要桥接两个光学表面之间的间隙以进行测量。在应用程序软件中选择“测量”。该软件将自动计算核酸浓度和纯度比率。样品测量后，检查光谱输出。该软件将自动计算核酸浓度和纯度比率。样品测量后，检查光谱图像以评估样品质量。典型的核酸样品将具有非常特征的特征。
图1.典型的核酸样品具有非常特征的特征与特定核酸分离技术相关的常见污染源包括苯酚/Trizol和柱提取。在苯酚/Trizol提取的情况下，残留试剂污染可以通过至nm之间的异常光谱以及至nm区域的移位来指示。相反，来自柱提取的残留胍可能有助于nm附近的峰值和波谷从nm变化到约nm。
图2.与样品A相比，样品B和C的峰和谷的变化说明了污染物如何影响核酸样品的光谱为了准确评估样品质量，应分析/或/比率以及整体光谱质量。对于DNA和RNA，纯核酸通常分别产生~2.8的/比率和~2.02/的比率为~2.0。该比率取决于用于进行空白和样品测量的缓冲液的pH和离子强度。酸性溶液将低于0.2-0.3的比率，而基本解决方案将超过0.2-0.3的比率。显着不同的纯度比可能表明存在蛋白质，苯酚或其他在nm或nm附近强烈吸收的污染物。/纯度比是DNA纯度的第二个量度，“纯”核酸的值通常在1.8-2.2的范围内。NanoDrop分光光度计还可用于使用直接吸光度或通过蛋白质比色测定来定量蛋白质。为确保适当的色谱柱形成和重复性，建议使用2μl样品进行蛋白质样品。
2.使用NanoDrop荧光光谱仪进行高灵敏度微量核酸定量
为了展示使用NanoDrop的高灵敏度微量核酸定量，使用PicoGreen荧光试剂盒。首先，将试剂盒标准品和所有核酸样品平衡至室温。荧光样品对光敏感，应保存在琥珀色或铝包裹的管中。为所有标准品和待测样品以及所需的PicoGreen工作溶液准备足够的1xTE缓冲液。按照制造商的方案，用不含核酸酶的水稀释提供的20xTE缓冲液，制备1xTE缓冲液。反应体积可以从μL到低至10μl。在该实施例中，将制备10μL反应体积。在无核酸酶的小瓶或试管中以2倍最终所需浓度制备连续稀释的dsDNA标准品。将5μL每种稀释的dsDNA标准品转移到单独标记的无核酸酶的琥珀色或箔覆盖的管中。将5μL目标dsDNA样品等分到适当标记的无核酸酶的琥珀色或箔覆盖的管中。根据制造商的协议准备PicoGreen工作解决方案。将等体积的PicoGreen工作溶液转移到每个含有标准品或感兴趣样品的管中（本例中为5μL）。结合等体积的1xTE缓冲液和PicoGreen工作溶液，制备阴性对照，作为参考溶液。通过温和移液彻底混合每个反应管的内容物，并在室温下孵育反应5分钟。所有标准品和样品应在测量前平衡至相同温度，因为荧光信号受温度影响。要准备仪器并进行测量，首先清洁样品保留系统的下表面和上表面。将2至3μL去离子水吸移到下部光学表面上，然后关闭然后打开杠杆臂，并用干净，无绒毛的实验室擦拭物擦拭上下基座。在进行之前确保表面没有棉绒，因为棉绒在激发源存在时会出现荧光，并且会干扰测量。打开仪器软件，选择“NucleicAcids”应用程序，然后选择“PicoGreen-dsDNA”选项。要清空仪器，请将2μL1xTE添加到下部基座，合上臂，然后在仪器软件字段中选择“空白”。空白完成后，从样品保留系统的两个表面上除去空白溶液。通过轻轻吹打混合参比溶液。使用低保留吸头，将2μL移液到下基座上并关闭臂。在测量类型中选择“参考”，然后选择所需的单位。单击“测量”以启动测量循环。测量周期结束后，打开手臂并彻底清除样品固定系统表面。每次重复使用新鲜的等分试样测量参考的最多五次重复。对其他标准重复此过程以构建标准曲线。最多可使用七种标准。该软件旨在为每个标准存储多达五个重复项。对标准品的重复进行平均以产生标准曲线，从该曲线自动确定样品浓度。标准曲线完成后，选择“样品”选项卡，输入相应的样品ID信息并测量每个未知样品。
DISCUSSION
这里介绍的定量协议是基于最广泛接受的微量系统。这种系统提供了实用的替代传统的核酸定量方法，依赖于更大的样品量和遏制仪器的使用。
NanoDrop微量技术采用了一种依赖对所测样品，形成液柱的表面张力特性的样品保留系统。重要的是，样品与适当的列形成上下光学测量表面接触。如果在任何点的测量结果似乎不准确或不重复，这是最有可能的样本异质性或液柱断裂的结果。
洗涤剂和异丙醇的清洁剂，因为它们可能uncondition基座测量表面不建议。一个无条件的基座已经失密时，会发生底座的疏水表面性质，导致在一个扁平化的样品液滴。在测量过程中，无条件的底座可以导致液柱断裂。
图3。无条件的表面特征是由水滴压扁
Uncondtioned基座表面，可翻新使用NanoDrop立柱翻新剂（PR-1，ThermoScientific的NanoDrop产品）。一个翻新复合一层薄薄的上部和下部的底座表面，让其干燥30秒，然后使用一个清洁，干燥，无尘的实验室擦拭磨去。成功修复的状态是由水珠串适用于底部的基座表面时，液滴的特点。
图4：一个翻新的表面特征是由水滴钉珠
微量定量系统，大大降低了样品消耗和更传统的量化系统相比显着增加的浓度范围。尽管微量定量甚至常常成为一个涉及有限的细胞团，如穿刺活检和激光捕获显微切割，效率和易于使用这种方法已被广泛接受的替代传统的核酸定量方法的情况下，使技术当样本是充足的。
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